Постановка методов, дизайн экспериментов, статистическая обработка данных, подготовка к печати результатов научных исследований (написание статей)

Экспериментальная работа (молекулярное клонирование, трансфекция/трансформация/трансдукция, очистка/измерение ДНК/РНК/белка, ПЦР/ПЦР в режиме реального времени, иммуноблотинг (WB), работа в клеточном блоке (адгезивные, семиадгезивные, неадгезивные клетки),..
Написание статей по результатам исследований , ведение переписки с редакцией
Опыт написания и подачи гранта/Совместная работа со студентами и аспирантами (научное руководствоюконсультация)

Для определения молекулярного механизма НАД+-зависимой формиатдегидрогеназы (ФДГ), были получены белки с точечными мутациями в активном центре фермента методом сайт-направленного мутагенеза. Рекомбинантные белки были экспрессированы в E. coli после чего нами были исследованы pH зависимости констант Михаэлиса и констант ингибирования субстратов и ингибиторов ферментативной реакции, а также спектральные характеристики. Было показано, что ферментативная реакция протекает с переносом гидрид-иона, и что перенос гидрид-иона является скорость лимитирующей стадией ферментативного процесса. Vmax ферментативной реакции оставалась постоянной между pH 6,0 и 11,2. При pH ниже 6,0 значение Vmax уменьшалось по причине протонирования двух карбоксильных групп на стадии переходного состояния реакции. Сродство фермента к НАД+ постепенно снижалось при pH 10,5 и выше по причине депротонирования гуанидиновой группы на участке связывания кофермента. Анализ рекомбинантных белков подтвердил участие гуанидиновой группы Arg284 в связывании кофермента и двух близко расположенных карбоксильных групп остатков аспарагиновой кислоты (Asp221 and Asp308) в связывании субстрата (аниона формиата). Ингибиторный анализ, CNS-, CNO-, N3-, и ADPR позволил установить, что ФДГ, полученная из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp. 101, имеет неупорядоченный механизм связывания субстратов, тогда как ФДГ метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha связывает субстраты и освобождает продукты реакции упорядоченно: вначале фермент связывает НАД+, а затем – формиат. Кроме этого, вначале активный центр покидает CO2, а затем - НАДН. Конкуренция между ионом формиата и пиридоксалем за общий сайт связывания позволил высказать предположение о существовании субстратного канала. Кроме этого, нами было определено, что пиридоксаль блокирует субстратный канал, связываясь со свободной аминогруппой белка. Последующий рентгеноструктурный анализ ФДГ при высоком разрешении (2Å) подтвердил существование канала и роль аминогруппы Lys286 в связывании пиридоксаля. Таким образом, каталитический процесс происходит посредством переноса гидрид-аниона от формиата к НАД+. Arg284 принимает участие в связывании НАД+, Asp221 и Asp308 – в связывании формиата. Молекула дрожжевого фермента имеет субстратный канал, который может быть блокирован пиридоксалем посредством образования основания Шиффа с Lys286.

Изучение функциональной роли Сукцинил тиокиназы из грудной мышцы голубя