«Классическая» ПЦР — стандартный скилл

ПЦР придумали для оптимизации лабораторной работы, чтобы создавать множество копий конкретного фрагмента ДНК из исходного образца. В результате 20-30 циклов реакции содержание этого фрагмента в пробе повышается на множество порядков по формуле:

 

где N — количество молекул на момент цикла n, E — эффективность амплификации (как правило, близкая к 2).

Процесс «размножения» фрагментов называется амплификацией. Чтобы поставить ПЦР, необходимо взять ДНК-полимеразу, праймеры, нуклеотиды, буфер с ионами магния для корректной работы фермента, а также раздобыть сам фрагмент нужной ДНК. ДНК-полимераза — это фермент, который строит новую цепочку молекулы на уже имеющейся матрице нужного фрагмента ДНК; праймеры — это затравка для синтеза новых цепочек ДНК; нуклеотиды выполняют роль строительных кирпичиков, из которых синтезируется новая цепь. Все эти компоненты «плавают» в буфере, который поддерживает нужные для реакции условия.

Каждый из циклов амплификации включает в себя три этапа: денатурацию, отжиг и элонгацию.

 

— При денатурации фрагмент ДНК нагревают, чтобы расплести двуцепочечную молекулу и сделать ее доступной для «клонирования».

— Затем идет стадия отжига, когда смесь охлаждают на несколько десятков градусов, чтобы праймеры смогли зацепиться за нужный участок ДНК. Этот процесс очень специфичен: длины праймера 18-22 нуклеотида обычно достаточно для точного распознавания единственного участка во всём геноме!
Про этот процесс говорят: праймеры «отжигаются на матрице».

— Наконец, в процессе элонгации тот самый праймер удлиняется благодаря тому, что ДНК-полимераза достраивает вторую цепочку ДНК из нуклеотидов.

Сложность классической ПЦР можно оценить на 3 из 10, где 10 — максимально сложно. Владение этим методом — стандартный пункт в портфолио студентов-биологов, которые знакомятся с протоколом ПЦР на лабораторных практикумах. Когда вы составляете резюме на вакансию выше уровня лаборанта-исследователя, можно даже не упоминать владение ПЦР: этот навык «по умолчанию» предполагается при работе в «мокрой» лаборатории.

«Прокачанная» ПЦР для резюме

ПЦР в реальном времени (real-time PCR, или qPCR) — количественный (quantitative) метод определения ДНК или РНК. В отличие от классической ПЦР, цель которой — скорее, наработать нужную последовательность или понять, есть ли она вообще в образце, метод ПЦР в реальном времени позволяет оценить количество исходной нуклеиновой кислоты в пробе. Метод назвали так потому, что накопление продуктов реакции фиксируется в реальном времени с помощью оптических датчиков.

Этот метод принципиально не отличается от классической ПЦР: протекание реакции анализирует прибор, а исследователь получает на выходе уже готовые данные. Однако дизайн эксперимента и пробоподготовка требуют специальных навыков и занимают больше времени. Так, одна из главных сложностей — высокая чувствительность метода, что повышает требования к «чистоте» проб, отсутствию в них «чужой», случайно занесенной ДНК (например, с поверхности рук). Таким образом, результат эксперимента с использованием real-time больше зависит от практических навыков исследователя.

Зачастую ПЦР в реальном времени применяют для оценки количества фрагментов РНК, а не ДНК: например, чтобы оценить, насколько активно экспрессируется тот или иной ген. В этом случае говорят о ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР, RT-PCR). Процесс экспрессии гена обязательно включает в себя этап переписывания генетической информации с ДНК на РНК, что дает исследователю возможность оценить, насколько активно «работает» ген в заданных условиях (например, в клетках конкретного пациента).

Особенность ОТ-ПЦР в том, что перед анализом нужно переписать информацию с мРНК на комплементарную ДНК (кДНК). В таком виде нужная нам генетическая информация становится более стабильной и пригодной для дальнейшей работы. При этом последовательность кДНК не содержит нефункциональных элементов гена — интронов.

Сложность real-time ПЦР с обратной транскрипцией можно оценить на 8 из 10. Причина такой оценки — в том, что с мРНК сложно работать: РНК, в отличие от ДНК, быстро разрушается. Это происходит во многом из-за вездесущих ферментов РНКаз, которые обычно присутствуют на коже человека. Поэтому лаборатории для работы с ОТ-ПЦР проектируют таким образом, чтобы минимизировать возможные загрязнения. Если вы овладеете этим методом, обязательно включите его в свое резюме — таких специалистов ценят работодатели.

Как прокачать ПЦР-скилл

Чтобы добавить ПЦР в копилку своих навыков, начинайте с «классической» ПЦР — чем раньше, тем лучше. Для овладения этим методом достаточно быть внимательным и научиться работать руками: пипетировать, аккуратно манипулировать с образцами, отработать процедуру до автоматизма. Несмотря на то, что метод легко автоматизируется — например, во многих лабораториях используют станции автоматического раскапывания, — важно освоить этот метод руками, чтобы разобраться в его сути и облегчить будущую работу с более продвинутыми видами ПЦР.

Когда накопите опыт с обычной ПЦР, начинайте осваивать другие виды — ПЦР-ОТ и иммуно-ПЦР в реальном времени, инвертированную ПЦР, цифровую ПЦР, есть даже изотермические ПЦР со шпилечными праймерами. В этом случае ваша ценность как специалиста будет определяться навыками подборки праймеров и умением интерпретировать результаты.

Статья подготовлена Анной Гобовой для Бластим